Project Funding Details

Description of the problem Breast cancer is classically recognized as a heterogenous disease. For the last 20 years, it is known that different molecular subtypes exist, with distinct gene expression programs and patient prognosis. Substantial intratumoral heterogeneity has been described and recent reports have used scRNA-seq analyses to annotate intratumoral variation of transcriptional programs with single cell resolution. However, the transcription factors driving intra- and inter-patient regulatory heterogeneity remain understudied. It also remains unknown how the regulatory landscape changes in acquired therapy resistance or following progression to metastatic disease. Envisioned solution To identify the transcription factors driving breast cancer cell subpopulations at single cell resolution, we have implemented a novel technology to annotate active regulatory DNA elements: single cell combinatorial indexing Assay for Transposase- Accessible Chromatin using sequencing (sciATAC-seq). We will chart primary human breast tumors as well as the paired metastatic lesions from the same patients. We hypothesize that the ratios of these subpopulations may differ between tumors, and are selectively enriched following treatment selection pressure and sustain tumor survival. Our preliminary data show that different tumor cell subpopulations can be resolved using sciATAC-seq which have a distinct transcription factor repertoire. We will generate a compendium of intra- and intertumoral heterogeneity of regulatory landscapes to develop a deepened understanding of the transcription regulators driving distinct breast cancer cell subpopulations. Using on-site available PDX-models, we will determine how different treatment pressures affect intratumoral heterogeneity of the regulatory landscape. In parallel, we will characterize the identified regulators in cell line models for therapy sensitive and resistant disease. These studies will help us to understand the role of the identified transcription factors in driving the shift in the regulatory landscapes. We expect gain a better understanding of how specific treatments impose evolutionary pressure to enrich for specific tumor cell subpopulations. Aim We want to identify factors that drive intra- and interpatient heterogeneity in the regulatory landscapes in breast cancer (Figure 1). We aim to tackle this in three different ways: - Chart the inter- and intratumor regulatory heterogeneity using single-cell ATAC-seq on 40 primary breast cancers and reveal functional transcription factor (TF) activity. From these data we will identify gene regulatory prototypes that are distinct for and common between tumors. - Investigate the changes in the regulatory landscape upon metastasis. We aim to define the alterations that the tumor cells undergo in transcription factor activity upon metastatic outgrowth. - Study the initial changes in the regulatory landscape upon treatment with endocrine therapy using PDX models of breast cancer. We will treat PDX models with standard endocrine therapeutics (tamoxifen and aromatase inhibitor letrozole) and chart the effects using single cell ATACseq. Identified transcription factors will be perturbed with CRISPR-Cas9 in BrCa cell lines, to determine the impact of TF targeting on cellular fitness and proliferation potential under endocrine treatment selection pressure. Plan of investigation With support from the NKI biobank, we will select fresh frozen paired primary and metastatic samples with full clinical annotation from 40 breast cancer patients. To limit inter-tumor heterogeneity to specific tumor subtypes and to ensure sufficient statistical power in our analyses, we will exclusively select Estrogen Receptor positive (ER+) cases that present with liver metastases. We will perform sciATACseq on primary tumor samples to identify intra- and inter-tumour heterogeneity in the regulatory landscape of ER+ tumors. Our preliminary data shows that we have the protocols up-and-running to generate the data. Importantly, we have the computational tools in place to analyse these high-dimensional data. We expect to identify cell types common between tumors from different patients, but also cell types that have a regulatory landscape that is specific to one or a subset of patients. Analysis of the sciATACseq data will be geared towards the identification of transcription factor regulatory landscapes that enable classification of distinct tumor cell subpopulations. To identify the changes that occur during metastasis we will also profile the regulatory landscapes using sciATACseq on the metastatic lesion from the same 40 patients. This paired primary-metastasis dataset will be a unique resource that will enable us to answer important questions with regards to tumor evolution. We will investigate how the regulatory landscape will change under the influence of i) the microenvironment of the metastatic site and ii) under treatment pressure. We expect our analyses to reveal how drug-imposed selection pressure enriches for distinct tumor cell populations in the treatment-resistant metastatic setting, that are driven by a specific set of transcription factors. The paired primary/metastatic design of our study does not allow us to evaluate the effect of endocrine therapy alone on the regulatory landscape of tumors in the clinical setting, without the influence of the metastatic component. To address this, we will use PDX models of ER+ breast cancer, which are available in-house. PDX mice will be treated with standard endocrine therapies for treatment in the adjuvant setting (tamoxifen or the aromatase inhibitor letrozole) and the tumors will be characterized with sciATACseq. Resistance driver potential of the identified TFs will be confirmed by CRISPR-Cas9 knockout in both parental and therapy-resistant breast cancer cell lines, followed by proliferation analyses. These findings will not only provide a basic understanding of how transcriptional programs in breast cancer are regulated, but will also reveal acquired dependencies on the TFs driving these programs. These findings will shed light on the evolution of metastatic breast cancer, whether and how features of metastasis may already pre-exist in cellular subpopulations in the primary tumor, and which TFs could be considered drivers in this context. Expected outcome The data we generate will, for the first time, create a comprehensive index of the regulatory heterogeneity within tumors and the changes that occur upon metastasis. We expect that our studies will provide a basic understanding of metastasis formation and how specific treatments may enrich for tumor cell subpopulations with distinct transcriptional programs, identifying critical drivers of treatment resistance.   

Leder jaar krijgen er wereldwijd meer dan 2 miljoen vrouwen de diagnose borstkanker en overlijden er ruim 620.000 patiënten jaarlijks aan de gevolgen van de ziekte. Er zijn verschillende soorten borstkanker, die we ‘subtypes’ noemen. Het meest voorkomende subtype wordt gevonden bij ongeveer 75% van de vrouwen met borstkanker. Dit subtype bevat de oestrogeenreceptor (ER), een eiwit dat een soort antenne is voor het vrouwelijke hormoon oestrogeen. Daarmee is dit subtype ook vaak afhankelijk van dit hormoon. De ER kan aan het DNA van de tumorcel binden na activatie door het hormoon oestrogeen, waarna de ER de tumorcel aanzet tot vermenigvuldiging en groei van de tumor. Deze directe afhankelijkheid van hormonen is ook een unieke zwakke plek van de tumor. Daarom worden veel patiënten met met dit type borstkanker worden vaak behandeld met hormonale therapie, waardoor deze signaleringsroute wordt geblokkeerd zodat de tumorgroei wordt geremd. Helaas is deze behandeling niet voor alle patiënten succesvol en zal de tumor bij sommige patiënten terugkomen in de vorm van een uitzaaiing (metastase). Een uitgezaaide borstkanker heeft zich over de jaren aangepast om te overleven in de aanwezigheid van hormonale therapie. In deze vergevorderde fase van de ziekte zien we specifieke eigenschappen naar boven komen van de uitgezaaide tumor, zoals hele specifieke veranderingen in het DNA dat de code bevat van de oestrogeenreceptor of doordat in de tumor geen oestrogeenreceptor meer aanwezig is. Uit eerder onderzoek van ons team en werk van anderen, weten we dat een enkele borstkanker opgebouwd is uit verschillende ‘subpopulaties’ van tumorcellen, en dat iedere borstkanker een eigen unieke combinatie heeft van deze kleinere groepjes van tumorcellen. Over de afgelopen jaren, hebben we een nieuwe technologie ontwikkeld in het lab, waarmee we in staat zijn om deze subgroepen van tumorcellen te ontdekken. Hierbij kijken we niet naar welke genen er specifiek aan staan, maar juist hoe deze genen worden aan gezet. Deze unieke aanpak het meten van ‘hoe open/toegankelijk’ het DNA is op specifieke plekken. Met deze techniek kan worden bepaald welke eiwitten waar precies op het DNA binden. Met specifieke computerprogramma’s, die we zelf gaan ontwerpen voor dit onderzoek, zullen deze resultaten aan elkaar gekoppeld worden, zodat we beter begrijpen hoe genen in borstkanker exact worden gereguleerd, op het niveau van de individuele tumorcel. Dit is een volstrekt innovatieve manier van het bestuderen van de biologie van kanker, en is nog nooit eerder toegepast bij borstkanker. Door onze studies uit te voeren op zowel primaire borsttumoren als uitzaaiingen van dezelfde patiënt, gaan we bepalen in hoeverre specifieke ‘tumorcel subpopulaties’ dominant aanwezig zijn in de uitzaaiing. Door deze tumorcel subpopulaties eerst te detecteren en vervolgens specifiek te blokkeren in cellijn modellen en ‘patient-derived xenograft’ (muizen waarin tumoren van patiënten zijn ingebracht), zullen we de hypothese testen of deze subpopulaties daadwerkelijk worden verrijkt na behandeling, en of het remmen van deze subpopulaties het ontstaan van therapieongevoeligheid kan voorkomen. Daarnaast maken deze modelsystemen het mogelijk om de biologische basis van therapieongevoeligheid bij borstkanker beter te begrijpen. Deze kennis zal ons meer leren over hoe ongevoeligheid voor borstkankerbehandeling ontstaat, maar zal ons daarnaast ook in staat stellen om een betere voorspelling te maken of er therapie ongevoeligheid zal optreden, en hoe deze het beste kan worden bestreden.