Project Funding Details

Problem The RAS genes (HRAS, NRAS and KRAS) are the most frequently mutated genes in cancer, occurring in about 30% of all types of human cancer1–7. These genes encode homologous RAS proteins that function as molecular switches, relaying signaling events from membrane receptors to downstream effectors which, in turn, promote cell growth and survival. These oncogenic mutations occur only at a limited number of hotspots and keep RAS in a constitutively active state. In normal cells, RAS proteins cycle between an inactive GDP-bound (‘off’) state and an active GTP-bound (‘on’) state. The transition between these two states is regulated by GEF proteins, required to release the GDP from RAS, and GAP proteins, which enhance the GTPase activity of RAS. GAPs are therefore critical for RAS inactivation and the subsequent shutdown of the signaling promoting cell growth. Oncogenic RAS mutants are resistant to GAP proteins, leading to the constitutive activation of RAS signaling and uncontrolled cell growth. KRAS is the most commonly mutated oncogene (83% of all RAS mutants) with its G12 residue being most frequently substituted (82% of all mutations) with various different amino acids that all impair GAP function and KRAS deactivation1–7. RAS codon 12 mutation was identified almost 40 years ago8 and despite intensive research efforts, oncogenic RAS proteins are still largely considered ‘undruggable’ targets. Currently, available inhibitors rely mainly on indirect targeting of RAS and they equally affect oncogenic and normal RAS proteins, thereby interfering with normal signaling in healthy cells. A few promising strategies targeting selectively RAS mutants have also been developed, but are effective only against one specific RAS mutant. For instance, small molecules reacting covalently with the cysteine residue of the G12C mutant yielded very encouraging results. Unfortunately, G12C represents only 11% of all the G12 mutations, and these inhibitors are inactive against the more frequently observed G12D (33%) and G12V (23%) mutants. Hence, additional inhibitors are still desperately needed to efficiently inactivate the various mutant forms of RAS occurring in cancer1,2,9–12. Research direction The development of inhibitors targeting specific RAS mutants is extremely time- and resource- consuming with tremendously low success rates. Here, we propose to establish an original and ambitious screening procedure to discover modified truncated GAP proteins (cGAP) capable of inhibiting specifically the two most observed KRAS G12 mutants in cancers (G12V and G12D) for which no specific drug or inhibitor is available. The molecular basis for the loss of GTPase activity of RAS G12 mutants has been uncovered more than 20 years ago based on the structure of normal HRAS in complex with the human p120 GAP protein13. The substitution of glycine 12 with any other amino acid prevents the correct positioning of a catalytic arginine residue in the GAP protein, essential to stimulate the GTPase activity of RAS. Hence, we hypothesize that modified cGAP proteins accommodating the side-chain of the mutated G12 residue in RAS should restore its function and deactivate oncogenic RAS proteins. This hypothesis is partially based on an alignment of the region containing the active residue in numerous proteins across different species bearing a RasGAP domain, which revealed that different solutions have been adopted in the course of evolution to stimulate hydrolysis of GTP in small GTPase proteins such as RAS. These modified cGAP proteins, could then serve as a basis to design peptide-based inhibitors mimicking cGAP function against oncogenic RAS. Plan of investigation Hence, by screening a sufficiently large number of modified cGAP proteins bearing a randomized region around the catalytic arginine residue, one can reasonably assume that a modified conformation of the protein should be able to accommodate the mutated G12 residue and restore oncogenic RAS GTPase activity. In other words, the proposed strategy can be seen as a lock-and-key problem: the mutations change the structure of the lock (RAS). Therefore, one must find the right key (modified GAP) to shut down the otherwise constitutively active oncogenic RAS proteins. cGAP candidates displaying an activity against mutated RAS will be discovered by a saturation mutagenesis screen using an original and powerful positive selection approach based on the restricted expression of a puromycin resistance marker exclusively in cells that have lost RAS activity. In contrast to classical loss-of-function screens, such as shRNAs or CRISPR screens, this approach does not require the otherwise prohibitive number of cells that would be necessary to maintain sufficient coverage of the large number of different DNA sequences encoding cGAPs. The proposed approach will allow the identification of mutagenized GAP proteins capable of arresting cell proliferation without the need of DNA sequence-enrichment analyses. This is made possible thanks to already available isogenic cell lines expressing only a single human (mutated or wild-type) KRAS protein, whose activity is essential for their proliferation, combined with the use of tailored reporter/selection markers that will be developed for this application specifically. Expected outcome Once candidate cGAP proteins are identified, the conformation of the randomized region will be used to design more amenable synthetic inhibitors using chemical biology approaches. More specifically, modified peptides (peptidomimetics), that resemble the structure of the active part of the cGAP proteins and that can assume the function of the entire protein, will be synthesized based on homology models of identified active candidates and their activity against oncogenic KRAS tested in in vitro GTP hydrolysis assays. Development of peptidomimetic inhibitors have already proven successful against other cancer-relevant protein such as p53/MDM2 (ALRN-6924 currently in Phase IIA clinical trial)14,15, β-catenin16–18 and BCL-219, for instance. This research may thus constitute a first step towards the development of KRAS G12D or G12V specific inhibitors. Consistent with the KWF unique high-risk call, the aim of this project is hence to acquire the essential preliminary data, in the form of active cGAP proteins and derived peptides, which are a mandatory step in the design of bioactive drugs. With these results, we aim to secure further funding to support the development of potent inhibitors targeting cancers relying on mutated RAS oncogenes that could benefit not only the research community but patients if a potent therapeutic agent can be developed.

Achtergrond en onderzoeksrichting RAS-eiwitten zijn belangrijk voor normale cel proliferatie, migratie en overleving die normaal gesproken strikt worden gecontroleerd en alleen geactiveerd raken als reactie op specifieke signalen. Veel tumorcellen vertrouwen op het gemuteerde RAS-eiwit om te kunnen groeien en metastasen te vormen, waardoor RAS-genen de meest algemeen gemuteerde oncogenen zijn bij kanker. Deze mutaties zijn verantwoordelijk voor meer dan een miljoen sterfgevallen per jaar wereldwijd. Veel van de meest agressieve en therapieresistente tumoren hebben RAS mutaties, zoals pancreaskanker, darmkanker en niet-kleincellige longkanker. Kankers met gemuteerd RAS worden daarom vaak geassocieerd met een slechte prognose. Deze mutaties houden RAS in een constitutief actieve toestand om op die manier deactivering door GAP-eiwitten te voorkomen. Ondanks dat deze oncogene mutaties meer dan 30 jaar geleden zijn geïdentificeerd blijft de ontwikkeling van effectieve therapieën ongrijpbaar en wordt het vinden van medicijnen tegen kankers met RAS-mutaties vaak de "Heilige Graal" of "Everest" genoemd. In dit onderzoek stellen we een nieuwe strategie voor om het oncogene RAS aan te pakken door het probleem te behandelen als "een slot en een sleutel" -probleem. Inderdaad, de mutaties veranderen de structuur van RAS om deze in actieve toestand te vergrendelen, zodat de normale "sleutel", GAP, niet meer overeenkomt met het slot. Daarom heeft men een aangepaste GAP "sleutel" nodig om het gewijzigde RAS "slot" te deactiveren. Ons oorspronkelijke idee is om de kracht van natuurlijke selectie te ontketenen door verbeterde GAP-eiwitten te genereren die mutant RAS deactiveren en kankercellen kunnen doden. Op het moment dat deze GAP-"sleutels" bekend zijn, kunnen hun atomaire structuren worden gebruikt om kleinere geneesmiddelen te ontwerpen die lijken op het aangepaste GAP, maar dezelfde functies kunnen aannemen als een volledig gemodificeerde GAP-eiwit. Daarom beoogt het voorgestelde onderzoek de weg vrij te maken voor de ontwikkeling van nieuwe antikankermedicijnen die zich gedragen als geen ander die tot dusver is getest. Relevantie RAS-mutante kankers, zoals pancreas-, darm- en niet-kleincellige longkanker, behoren tot de meest agressieve vormen van kanker. Deze RAS-mutante kankers zijn verantwoordelijk voor meer dan 1 miljoen sterfgevallen per jaar. Ondanks het feit dat RAS het eerste menselijke oncogen was dat werd ontdekt, hebben jaren van intensief onderzoek niet veel effectieve therapieën opgeleverd. Dit wijst erop dat de gebruikelijke werkstromen van geneesmiddelenontwikkeling niet zijn aangepast. Daarom stellen we hier een radicaal andere benadering voor: specifiek gericht op gemuteerd RAS die, indien gefinancieerd door KWF en succesvol, zou kunnen leiden tot de ontwikkeling van peptidegeneesmiddelen die veel agressieve tumoren in de toekomst beter behandelbaar kunnen maken. Onderzoeksopzet Ons doel is om de moeilijke allereerste stappen van een krachtige medicijnontwikkeling aan te pakken: de identificatie van een kunstmatig GAP-eiwit dat fungeert als een sleutel om actief RAS te ontgrendelen, zodat zijn activiteit wordt gestopt en de groei van kankercellen kan worden geblokkeerd. Om dit te bereiken stellen we voor om:  Een groot panel van (1,8 miljoen) gemodificeerde GAP-eiwitsequenties te genereren door alle mogelijke eiwitbouwstenen rond het actieve deel van normaal GAP te gebruiken om de structuur van de "sleutel" te kunnen veranderen. Al deze GAP-sequenties, die afhankelijk zijn van de twee meest algemeen waargenomen RAS-mutaties (die elk ~ 30% van de RAS-mutaties vertegenwoordigen), in cellen te introduceren om te groeien. Vervolgens willen we alleen cellen selecteren die een actief GAP hebben met behulp van een genetische RAS-activiteitssensor die is gekoppeld aan een selectiemarker. Op deze manier kunnen we alle cellen elimineren die inactieve gemodificeerde GAP-eiwitten tot expressie brengen, waardoor enkel cellen overblijven met actieve GAP-eiwit expressie die mutant RAS kunnen remmen. Modellen van de structuur van de geïdentificeerde actieve GAP-eiwitten opstellen om te begrijpen hoe RAS wordt gedeactiveerd door het gemodificeerde gebied in GAP. We gebruiken deze informatie uiteindelijk om hun activiteit te evalueren door peptidemoleculen (kleine delen van het gemodificeerde GAP-eiwit) te ontwerpen die kunnen worden gesynthetiseerd en getest op kankercellen. Verwachtte uitkomsten De eerste verwachte uitkomst van dit project is daarom de identificatie van ten minste twee actieve GAP-eiwitten tegen de twee meest voorkomende gemuteerde RAS-eiwitten. Deze GAP-eiwitten mogen ook niet actief zijn tegen normaal RAS, welke belangrijk is voor normale cellen. Het tweede verwachte resultaat is het verkrijgen van een model van de atomaire structuur van deze eiwitten. Dit is essentieel voor de ontwikkeling van actieve peptidegeneesmiddelen die zal zijn gebaseerd op de structuur van het GAP-eiwit van belang. Het doel is hier om een peptidegeneesmiddel te verkrijgen dat dezelfde activiteit zal hebben als het actieve deel van het hele GAP-eiwit door dezelfde structuur aan te nemen. Het onderzoeksteam is er eerder in geslaagd om peptidegeneesmiddelen te ontwikkelen voor andere kankerrelevante eiwitten. Hierdoor zijn we er dus van overtuigd dat we na identificatie van de gemodificeerde GAP-eiwitten in staat zullen zijn om potentieel actieve, op peptide-gebaseerde, geneesmiddelen tegen RAS te kunnen ontwerpen. Hoewel het project niet onmiddellijk een actief middel voor menselijke therapie zal opleveren, is dit zeker een hoognodige en essentiële eerste stap om te nemen. Implementatie Om een tijdige afronding van de onderzoeksdoelstellingen te waarborgen wordt het onderzoek uitgevoerd door een complementair team van onderzoekers met expertise in verschillende aspecten van het onderzoek in zowel het Cancer Center Amsterdam van het Amsterdam UMC, locatie VU medisch centrum als bij de afdeling Organische Chemie en Farmaceutische Wetenschappen van de Vrije Universiteit Amsterdam. De identificatie van de gemodificeerde GAP-eiwitten zal worden uitgevoerd door een onderzoeker met expertise in de screening van gerandomiseerde sequentiebibliotheken en celgebaseerde testen aan het VUmc, terwijl de structurele karakterisering van actieve GAP-eiwitten en het ontwerp van kandidaat-peptidegeneesmiddelen zal worden verzekerd door experts in structuurbepaling, ontwerp en synthese van peptidegeneesmiddelen. De resultaten van dit project zullen door middel van publicatie in open access biomedische tijdschriften en presentaties op internationale bijeenkomsten worden gedeeld om nieuwe samenwerkingen en verdere ontwikkeling van aanpak te stimuleren. Als de resultaten duiden op de identificatie van een veelbelovend kandidaat-peptidegeneesmiddel, willen we de bevindingen ook communiceren naar het grote publiek en kankerpatiënten via de PR-afdeling van het Amsterdam UMC en de VU, alsmede via sociale mediaplatforms.