Project Funding Details

Problem description: Drug resistance to treatment in cancer cells is a major cause of recurrence and therapy failure in patients. This is particularly the case in hepatic cancers where efficiency of therapy is low and patient survival dismal. While in some cases drug resistance emerges due to mutations (genetic heterogeneity), recent data suggests that in other cases drug resistance can emerge due to fluctuations in cell state or cell identity that are non-genetic, rare and transient in nature (epigenetic heterogeneity). The transient nature of these states complicates the identification of such states and thus prevents their exploitation in intelligent therapy design. Research direction: In order to overcome these limitations and enable the discovery of transient tumor cell states that are relevant for therapy escape, we deploy a system fusing a bacterial methyl transferase (DCM) to a mammalian polymerase 2 (Pol2rb). Activation of the fusion protein leaves a permanent methylation print on active genes which can be recovered at a later point when the cell has undergone changes in its identity. This system allows the tracing of cell state (gene signatures as well as enhancer activity) across long time intervals in vivo.   The aim of the current proposal is to deploy this new system as a model to trace the state of cancer cells that survive treatment back in time prior to treatment start. Our hypothesis is that our cell state tracing system can discover new and transient cell states that help a cancer cell to escape therapy. Our ultimate aim is to target these resistant states with modifiers to reduce treatment escape and improve therapy response and patient survival. Plan of investigation: We will deploy the Pol2rB-DCM cell state trace system optimizing it for high throughput use in human cancer model systems. We will optimize control over expression of the fusion protein allowing the recording of cell state across short time intervals and the selection of cells that had their state recorded in the past. Following this we will deploy the system in several human cancer models analyzing cancers that are highly heterogeneous focusing first on hepatocellular carcinoma (HCC) and combined hepatocellular cholangiocarcinoma (CHC). We will extend these analyses to include glioblastoma as well as cancer organoid models of the digestive tract (pancreas and stomach) depending on outcome. We will measure cell state prior to and following chemotherapy treatment by analyzing DCM methylation (recorded state) and RNA (current state) in the same cell. Finally, we will conduct proof of principle experiments testing the system in a mouse model for a hepatocellular carcinoma as well as in fibrolamellar carcinoma, a rare type of hepatic cancer mainly effecting young people. Testing the system across multiple models will enhance our ability of finding rare or transient cell states associated with treatment escape in hepatic cancer that can be exploited to improve therapy. Based on the analysis improved treatment strategies will be proposed and tested in each model to prevent therapy escape. Expected outcome and relevance: The results emerging from this study will reveal gene signatures and enhancer activity of tumor cell states that are typical of treatment surviving cancer cells prior to or as they undergo treatment. This will reveal whether or not rare and transient states may help a cancer cell escape therapy in the various models tested. The outcome of these analyses will help instruct better therapy design for these cancers and may improve patient survival. The approach, once validated has wide utility across different types of cancer and may be further developed as a clinical diagnostic tool to predict therapy response in primary patient material.  

Achtergrond en probleemstelling: Resistentie tegen systemische therapie (chemotherapie) is de belangrijkste oorzaak van het falen van behandeling in patiënten. Dit is bij uitstek het geval bij verschillende vormen van leverkanker waar afhankelijk van het type de gemiddelde overleving tussen te 12 en 60 maanden licht. In sommige gevallen is resistentie tegen therapieën het gevolg van mutaties in kankercellen die resistentie verhogen. Echter, recent is ook gebleken dat kankercellen voortdurend van identiteit (epi-genetische staat) wisselen en dat de tijdelijke staat waar de kankercel zich in bevind kan bijdrage aan het falen van therapie zonder dat daarvoor mutaties nodig zijn. Deze tijdelijke staat is vaak zeldzaam en kortdurend waardoor hij moeilijk te zien is en verdwijnt als de tumoren weer uitgroeien na behandeling (zie figuur 1). Het is dan ook lastig om therapieën te ontwikkelen die zulke zeldzame en kortdurende transities in de identiteit van de kankercel te modificeren om zo de chemotherapie effectiever te maken. Om dit te kunnen doen zouden we de kankercellen moeten isoleren die de therapie hebben overleefd en terug in de tijd moeten kijken naar hoe die kankercel zich gedroeg op het moment dat therapie begon. Onderzoeksrichting / oplossing: Om dit probleem aan te pakken hebben wij een nieuw systeem ontwikkeld waarmee we de staat/ identiteit van een kankercel kunnen teruglezen in de tijd. We hebben een moleculaire recorder gegenereerd door een bacterieel eiwit wat methyl groepen op het DNA kan plaatsen te fuseren aan het eiwit wat genen afleest (Pol2rB-DCM cell state trace system). Dit eiwit kunnen we kort aanzetten waarna het een voet afdruk achter laat op het DNA van genen die op dat moment afgelezen zijn (recorder) wat op een later tijdstip uitgelezen kan worden. Door op een later tijdstip tegelijk te kijken te kijken naar de genen die op dat moment aanstaan (huidige staat/ identiteit) van de cel) en tegelijk de voetafdruk van methyl groepen die daarvoor gezet is (vorige staat/ identiteit van de cel) kunnen we terug in de tijd kijken. In onze eerste onderzoeken laten we zien dat dit systeem werkt in muizen modellen waar we kijken hoe cellen veranderen over de tijd. Dit systeem is natuurlijk dan ook bij uitstek geschikt om te kijken naar overlevende kankercellen om erachter te komen in wat voor staat deze cellen zich verkeerden op het moment dat begonnen werd met de therapie. Daarmee kunnen we voor het eerst deze kortdurende en zeldzame cel transities die de kanker resistent maken in het daglicht brengen. Op basis van deze informatie kunnen we hier vervolgens therapie op aanpassen om een identiteit te forceren die de cel gevoelig houdt voor therapie. Onderzoeksvragen, onderzoeksopzet: Om zeldzame resistente transities in kankercellen zichtbaar te maken zullen we het systeem optimaliseren voor gebruik in humane 2D en organoide culturen en samen met de groep van Jop Kind op het Hubrecht Instituut de resolutie verhogen om de analyse te kunnen toepassen in een enkele cel. We zullen het systeem inzetten in vormen van kanker waar cel transities veel gezien worden en waar ook geen effectieve systemische behandeling beschikbaar is. We concentreren ons onderzoek eerst op veelvoorkomende en zeldzame vormen van leverkanker; hepatocellular carcinoma (HCC) en combined hepatocellular cholangiocarcinoma (CHC). Hierbij worden we bijgestaan door experts in leverkanker (de groep van Jan Ijzermans) in de kliniek. Daarna breiden we ons onderzoek uit naar andere moeilijk te behandelen vormen van kanker waarvan bekend is dat er veel cel identiteit transities plaatsvinden waaronder glioblastoma, pancreas kanker en maagkanker. Buiten de humane kweek systemen zullen we ook ons muis model inzetten om zo deze zeldzame cel transities in de aanwezigheid van een meer relevante omgeving (aanwezigheid van bloedvaten, een werkend immuunsysteem en complex micro-omgeving) te kunnen testen. Op basis van de analyse van de overlevende cellen en de staat waarin ze verkeerde toen therapie begon, zullen we voorspellingen kunnen doen om de inductietherapie te verbeteren wat getest zal worden in de gebruikte modellen. Verwachte uitkomsten, relevantie, Door ons system in te zetten in de verscheidenen kankermodellen zullen we kunnen uitzoeken bij welke soorten kanker de aanwezigheid van kortdurende transities in de identiteit van de kankercel een rol spelen bij de resistentie van deze kankersoort tegen chemotherapie. Op basis van deze informatie zullen we deze kortdurende transities proberen te verstoren waardoor de chemotherapie beter zal werken. Dit is direct relevant voor de patiënt en in lijn met de missie van KWF om therapie te verbeteren. Terwijl we in dit voorstel een selectief groepje kankermodellen testen met een focus op leverkanker is ons systeem breed inzetbaar en mogelijk relevant voor meer soorten kanker. Daarbij kan ons systeem verder ontwikkeld worden om inzetbaar te zijn in primair patiënten materiaal om zo de effectiviteit van mogelijke behandelingen beter en sneller te kunnen voorspellen. Op basis van het onderzoek in het huidige voorstel zullen we deze strategie in vervolgonderzoek en met grotere samenwerkingen breder kunnen uitzetten en zullen ook andere onderzoekers onze methode kunnen toepassen.