Project Funding Details

Problem description and background:  Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) are a heterogeneous group of tumors, arising at different locations in the upper-aerodigestive tract and with multiple risk factors (e.g. smoking, alcohol, human papillomavirus (HPV)). Since 2016, patients with recurrent/metastatic disease can receive immunotherapy with anti-programmed death receptor (PD)-1 antibodies,(1,2) aimed at restoring the tumor killing abilities of T effector (Teff) cells. Though groundbreaking for HNSCC, the clinical benefit in overall survival (OS) “only” reaches 10% compared to standard-of-care treatment at 2-years follow-up.(3-5) A deeper understanding of the HNSCC TME at specific subsites is clearly warranted to improve the current response rates and to rationally design more effective (immuno)therapies.(6-9) Solution/research direction: Analyzing 192 patients from a large clinically well-defined retrospective oral SCC (OSCC) cohort for CD19 expression, we observed that patients with above median percentages of tumor-infiltrating B cells (TIL-B), had a better 5-year OS than patients with lower than median TIL-B. We found CD3+ T cells to be higher in the TIL-Bhigh group (p=0.007), but CD8+ T cell frequencies to be similar. A recent publication confirms our TIL-B findings in early stage OSCC.(10) They showed that a CD20 cluster score, looking at the distance between TIL-B with each other and with CD4 T cells in the invasive margin stromal compartment, was linked to a favorable prognosis. So while both studies underscore the importance of TIL-B in the OSCC TME, the exact flavor of B cells involved is unresolved. In this project, we will therefore investigate the type of B cells present in the OSCC TME e.g. (plasmablasts, plasma cells, memory-, naïve-, and regulatory B cells) and study with which cells within the TME those TIL-B subsets closely interact. We will assess in detail whether tertiary lymphoid structures (TLS) are formed(8), study chemokine expression profiles underlying immune cell recruitment, functionally assess B cell recruitment through trans-well experiments and investigate the presence, type and targets of HNSCC-directed antibodies. We will determine whether TIL-B are also prognostic in advanced stage OSCC and whether our findings apply to HPV-negative HNSCC at other sub-sites such as the larynx and/or pharynx. Aim/Hypothesis: The aim of this project is to characterize the type of B cells in the TME of OSCC and their place and role within the immune landscape. We hypothesize that TIL-B, of the Bmem phenotype, interact with CD4+ T helper (Th) cells and that plasma cells within the TME produce tumor-specific antibodies that may activate innate immune effector cells, thereby actively contributing to increased survival. Plan of investigation: We divided the work in three work packages (WPs). WP-1 entails multiplex fluorescent immunohistochemistry (m-fIHC) on FFPE tissue to dissect the type of TIL-B present in OSCC, study TLS formation and determine the interaction of TIL-B subsets with T cell- and myeloid cells. For WP-2 we will select TIL-Bhigh and TIL-Blow OSCC cases from our initial cohort of 192 patients, matched for relevant confounding clinicopathological factors, to perform nanoString gene expression analyses. We will assess whether specific gene expression signatures, such as TLS markers, chemokines and/or cytokines, explain the difference in immune cell infiltration in general and B cell infiltration in particular. RNAish will be performed to determine which cells produce the identified chemokines. As part of WP-2, we will phenotypically characterize the immune infiltrate in fresh OSCC biopsies by means of multi-parameter flow cytometry, focusing on the activation status and different subsets of TIL, including innate and adaptive effector cells. Culture supernatants from fresh tumor digests will be analyzed for chemokines and will be used in functional trans-well assays for the attraction of peripheral immune cells, using autologous PBMCs. PBMCs will be interrogated for B cell activation status to study whether there is a link between high TIL-B counts and increased peripheral B cell activation. The presence, isotypes and targets of HNSCC-specific antibodies in patient serum and tumor-digest culture supernatants will be determined by protein array. By designing a combined m-fIHC/RNAish panel based on the data of WP-1&2, in WP-3 we will verify whether similar immune cell subsets and chemokines/cytokines play a role in shaping a favorable TME in HPV-negative HNSCC at other subsites. Expected outcome: Understanding the gene expression signature of TIL-Bhigh TMEs, and the type of B cells playing a role, will guide future research efforts how to attract the right B cells, to improve response to (immuno)therapy and increase survival outcome.

Achtergrond en probleemstelling: Plaveiselcelcarcinomen in de mondholte zijn een vorm van hoofd-halstumoren die voornamelijk ontstaan door alcohol gebruik en/of roken.(17) Omdat patiënten met hoofd-halstumoren zich doorgaans laat presenteren, moeten zij vaak een intensieve behandeling doorstaan bestaand uit chirurgie gecombineerd met postoperatieve radiotherapie of chemoradiatie. Desondanks verliest ongeveer de helft van de patiënten met vergevorderde ziekte de strijd tegen deze vorm van kanker binnen vijf jaar na diagnose door toedoen van een tumor recidief of uitgezaaide ziekte. De intensieve behandeling van hoofd-halstumoren, waarbij afwijkingen in het gelaat, en spreek- en slikstoornissen kunnen ontstaan, heeft een negatief effect op de kwaliteit van leven van de patiënt. Nieuwe behandelmethodes zijn dus hard nodig om zowel de overlevingskansen te verhogen als de kwaliteit van leven te verbeteren. Sinds 2016 behoort immuuntherapie met antilichamen gericht tegen de programmed-death receptor (PD)-1 tot de behandelmogelijkheden voor patiënten met een terugkerende of uitgezaaide hoofd-halstumor.(1,2) Deze therapie heeft als doel om de interactie tussen PD-1 op tumor-dodende T-cellen en PD-1 liganden die aanwezig zijn in het tumor micromilieu te blokkeren, waardoor tumor-dodende T-cellen hun werk weer kunnen doen. Ondanks dat de effecten die hierbij zijn gezien opzienbarend zijn voor dit tumor type, heeft slechts een beperkte groep patiënten (10%) een verbeterde algehele overleving ten opzichte van patiënten die behandeld zijn met standaardtherapie.(3-5) Om een verbetering in algehele overleving te bewerkstelligen, zullen nieuwe immuuntherapie strategieën ontwikkeld moeten worden.  Voorgestelde oplossing/onderzoeksrichting: In 192 patiënten met mondholtekanker hebben we gevonden dat patiënten met een hoger dan gemiddeld percentage tumor-infiltrerende B cellen (TIL-B) een significant betere 5-jaars overleving hebben. Daarbij vonden we in een kleine dataset dat het totale aantal T cellen licht hoger was in tumoren met veel TIL-B, maar er geen verschil was in het percentage tumor-dodende T-cellen. Zeer recent heeft een andere onderzoeksgroep vergelijkbare resultaten gepubliceerd in vroeg-stadium mondholtekanker.(10) Het belang van TIL-B lijkt dus evident, echter weten we niet of het uitmaakt welk type TIL-B er aanwezig is. In dit project willen we uitzoeken welke subtypes TIL-B aanwezig zijn in mondholtetumoren en met welke cellen zij contact hebben in de tumor. Daarnaast bestuderen we of verhoogde aanwezigheid van TIL-B correleert met een specifiek patroon van immuun-cel aantrekkende moleculen (chemokines of cytokines). Tevens hebben we tot doel om te bestuderen of B-cellen in de tumor, als ook in het bloed van patiënten, geactiveerd zijn, tumor-antigeen specifieke antilichamen produceren en of we de aanwezigheid, het type en de specificiteit van zulke antilichamen kunnen bepalen in serum en tumor-kweekjes van patiënten en of dit correleert met een verhoogd percentage antilichaam-producerende TIL-B. Exploratief willen we kijken of deze antilichamen effector cellen kunnen activeren om mondholtetumor cellen te doden. We zullen bepalen of ook in laat-stadium mondholtetumoren TIL-B prognostisch van belang zijn en of onze bevindingen ook gelden voor hoofd-halstumoren die op een andere locatie in het hoofdhalsgebied zijn ontstaan. Onderzoeksdoel/hypothese: Het doel van dit project is om te achterhalen welk type B-cellen aanwezig zijn in het tumor micromilieu van mondholtetumoren, welke factoren zorgen dat TIL-B worden aangetrokken en wat hun functie is. Onze hypothese is dat geactiveerde TIL-B in het tumor micromilieu andere immuun cellen aantrekken en/of hun functioneren bevorderen, wat resulteert in een betere algehele overleving. Onderzoeksopzet: We zullen in drie werkpakketten (WP1-3) het onderzoek uitvoeren en onze hypothese testen. In WP-1 zal het immuun-landschap van mondholtetumoren worden bestudeerd door verschillende typen immuun cellen te identificeren in het weefsel middels specifieke markers en te analyseren welke cellen met elkaar een interactie aangaan. We zullen ook kijken naar de subtypes B cellen en nadruk leggen op de aanwezigheid van zogenaamde tertiaire lymfoïde structuren (TLS), welke in de literatuur zijn gelinkt aan een gunstig ziektebeloop.(8,18-21) Tevens zullen we uitzoeken of TIL-B ook van prognostische waarde zijn in laat-stadium mondholtetumoren. In WP-2 bestuderen we of verschillen in chemokine en/of cytokine genexpressie profielen tussen tumoren met hoge en met lage TIL-B waardes een relatie hebben met het immuun-landschap per se en de aanwezigheid van TIL-B in het bijzonder. Als vervolgstap wordt bestudeerd welke cellen in het tumor micromilieu deze chemokines/cytokines produceren en welke cellen erdoor aangetrokken worden (middels trans-well experimenten). Daarnaast zullen we in vers tumorweefsel, en in perifeer bloed van patiënten, de activatie van de immuun cellen karakteriseren en in tumor-kweeksupernatant en serum van patiënten met mondholtetumoren de aanwezigheid, het type en de anti-tumor herkenning bepalen van antilichamen. Op basis van de resultaten in WP-1/-2, zal er een panel ontwikkeld worden waarbij we naar de meest relevante immuun cellen en chemokines kunnen kijken op FFPE materiaal en zal deze in WP-3 worden toegepast om te onderzoeken of dezelfde factoren van prognostische waarde zijn in hoofd-halstumoren die op een andere locatie ontwikkelen zoals de larynx of farynx.    Verwachte uitkomsten: Onze verwachting is dat de aanwezigheid van TIL-B ook prognostisch gunstig is voor laat-stadium mondholtetumoren omdat ze de aantrekking en het functioneren van andere anti-tumor immuun cellen kunnen ondersteunen. Het ontrafelen van de subtypes en de chemokine/cytokine profielen in tumoren met een gunstig immuun-landschap (veel TIL-B) en ongunstig immuun-landschap (weinig TIL-B) zal nieuwe inzichten verlenen die ten grondslag kunnen liggen aan de ontwikkeling van nieuwe immuuntherapie strategieën gericht op het aantrekken van een immuun-infiltraat dat optimaal in staat is tumorcellen te herkennen en te doden. Relevantie en implementatie: de uitgebreide kennis over het type TIL-B, hun plaats in het immuun-landschap in mondholtetumoren en bijbehorende chemokine/cytokine expressie profielen zal nieuwe hypothesen genereren hoe we een gunstig immuun-landschap kunnen creëren in patiënten die dit van nature niet hebben. Als blijkt dat deze mechanismen gedeeld worden door hoofd-halstumoren die elders in het hoofdhalsgebied ontstaan, zou dit mogelijk ook relevant kunnen zijn voor andere epitheliale tumortypen.