Project Funding Details

Problem description Diffuse midline glioma (DMG) represents a highly aggressive, rare pediatric brain tumor with no chance of survival. Targeted treatment options are urgently needed, and efforts have been put towards the development of T cell therapies, including GD2-specific CAR T cells. However, in a pre-clinal model, GD2 CAR T cells failed to completely eradicate human DMG tumors, because of tumor cells lacking GD2 expression. Next to this variation in expression within tumors, GD2 heterogeneity between individual patients might further limit the width of GD2 CAR T cell efficacy. This illustrates the need for either improving existing CAR T cell therapies, or developing alternative engineered T cell approaches. Fulfilling this need requires in depth technology platforms to model T cell tumor interactions in a patient-specific manner. Solution/research direction To overcome challenges in tumor-specific ligand expression, T cells engineered to express an unconventional T cell receptor and thereby recognizing global metabolic changes in tumor cells are generating increasing interest. Through their metabolome-sensing and human leukocyte antigen (HLA)-independent recognition mechanism, these therapies provide promise for pan-tumor and even pan-population cancer targeting. Most notable examples include αβ T cells engineered to express a Vγ9/Vδ2 T cell receptor (TEGs), sensing metabolic changes through conformational changes in butyrophilin 2A1, and more recently described MR1 T cells thought to recognize metabolite ligands presented by MR1. We recently established preliminary data showing that TEGs are able to kill patient-derived DMG cells and confirmed MR1 expression in DMG patient tumor samples. Thus, unconventional TEGs and MR1 T cells could provide a valuable treatment option for patients with DMG, especially in cases where CAR T cell ligand expression is low. However, predicting their DMG targeting potential will require adequate immuno-oncology platforms that reflect inter- and intra-tumoral heterogeneity observed in patients. We recently developed such a platform; BEHAV3D, which implements organoid technology, 3D imaging and transcriptomics to pre-clinically evaluate the efficacy and mode-of-action of T cell therapies. Because patient-derived organoids (PDOs) retain specific features of their original tumor specimen, BEHAV3D can evaluate T cell therapy responses in a patient-specific manner. Using breast cancer PDOs, we were able to reveal both inter- and intra-tumoral heterogeneity in TEG targeting. Moreover, through single-cell tracking, we uncovered the full TEG behavioral landscape, demonstrating a high level of behavioral heterogeneity that was furthermore shaped by the type of PDO in culture. This highlights the importance of organoid technology to asses T cell tumor-targeting in a patient-specific manner. In addition, the high level of behavioral T cell heterogeneity detected using 3D imaging suggests that T cell therapies could be optimized by promoting the most potent tumor-targeting behavior. We applied behavioral-guided transcriptomics to reveal the dynamic gene signatures in TEGs underlying their tumor-targeting strategy. This enabled identification of a signaling pathway that could be manipulated to improve TEG targeting of otherwise resistant PDOs, as well as a surface marker that we used to select cells with the most potent tumor targeting behavior, thereby enhancing therapy efficacy. Aim/hypotheses Here, we propose to implement organoid technology and our single-cell imaging and transcriptomics platform BEHAV3D to advance T cell therapies for DMG. We hypothesize that (1) upcoming unconventional and metabolome-sensing T cell therapies - TEGs and MR1 T cells - can provide a novel immunotherapy outlook for patients with DMG, potentially complementary to GD2 CAR T cells, and (2) that efficacy of T cell therapies can be further enhanced through manipulation of targets identified using BEHAV3D. To test these hypotheses, we will establish the in vitro and in vivo DMG targeting efficacy of TEGs and MR-1 T cells in comparison to GD2 CAR T cells (Aim 1/WP1). We will classify T cell behavior using dynamic 3D imaging data and establish genetic profiling of both organoids and T cells to identify targets associated with sensitivity to treatment in organoids and potent tumor targeting behavior in T cells (Aim 2/WP2). Based on identified targets, strategies – such as T cell selection, combinatorial therapeutic approaches and ‘next-generation’ T cell engineering - will be designed and validated to optimize T cell therapy towards more effective DMG targeting (Aim 3/WP3). Plan of investigation To take into account inter- and intra-patient heterogeneity, we will use a recently established DMG PDO biobank. Importantly, our preliminary data confirm that DMG PDOs show both inter- and intra-tumoral heterogeneity in GD2 expression, allowing us to asses a potential therapeutic advantage of TEGs and MR1 T cells over GD2 CAR T cells. We will set-up a co-culture of PDOs with the different T cell products and through our multi-spectral live 3D imaging strategy we will quantify single organoid death dynamics to reveal intra-tumoral heterogeneity in response to T cell therapies. Moreover, comparing PDOs derived from over 10 DMG patients will allow assessment of inter-patient variability in responsiveness (WP1). Using this data, we will select the most relevant organoid lines for xenograftment in mice and local delivery of TEGs and MR-1 T cells into the brain to assess in vivo targeting potential in comparison to GD2 CAR T cells (WP1). Based on in vitro and in vivo results, we will select representative PDOs and the most promising metabolic T cell therapy, for behavioral classification and transcriptomic profiling to delineate tumor targeting strategy and underlying gene signatures (WP2). We will perform these in-depth experiments with T cell therapy low-sensitive and high-sensitive PDOs. Together with PDO transcriptomics profiling, this will provide insight on how the tumor inflammatory profile shapes the gene signature and behavior of T cells. Together, these findings will be used to identify novel targets for T cell therapy manipulation and design methods to further enhance efficacy based on either selection of potent T cell populations, combinatory drug targeting approaches, or ‘next-generation’ T cell engineering (WP3). Expected outcome Using our organoid technology, 3D imaging and transcriptomics innovation, we not only expect to identify and pre-clinically validate novel T cell therapies for patients with DMG, but furthermore develop therapeutic designs to further enhance their targeting efficacy. We hope that these therapeutic strategies can provide a better clinical outlook for patients suffering from DMG.  

Diffuus midline glioom (DMG) is een zeer agressieve, zeldzame pediatrische hersentumor zonder overlevingskansen. Gerichte behandelingsopties zijn dringend nodig, en medicijn ontwikkeling richt zich onder andere op T-cel therapieën, waaronder GD2-specifieke CAR T cellen. In een preklinisch model slaagden GD2 CAR T cellen er echter niet in om humane DMG-tumoren volledig te verwijderen door het ontbreken van GD2 op sommige cellen. Daarnaast kan GD2 heterogeniteit tussen individuele patiënten de effectiviteit van GD2 CAR T cellen beperken. Dit toont aan dat bestaande CAR T-cel therapieën verbeterd moeten worden of alternatieve T-cel behandelingen ontwikkeld moeten worden. Hiervoor zijn technologieën nodig die het mogelijk maken om T-cel-tumor interacties op een patiënt-specifieke manier in kaart te brengen. In dit onderzoeksvoorstel gebruiken we organoïde technologie en ons recent ontwikkelde 3D imaging en RNA-analyse platform; BEHAV3D om T-cel therapieën voor DMG te verbeteren. Door moeilijkheden in het vinden van specifieke liganden die homogeen op tumorcellen tot expressie komen, is er veel belangstelling voor T-cellen die ontworpen zijn om een onconventionele T-cel receptors tot expressie te brengen. Ze herkennen daardoor globale metabolische veranderingen in tumorcellen. Door deze eigenschap en hun HLA-onafhankelijke herkenningsmechanisme bieden ze een mogelijkheid voor pan-tumor kankertherapie. De belangrijkste voorbeelden van dit type cellen zijn αβ T-cellen die ontwikkeld zijn om een Vγ9/Vδ2 T-cel receptor tot expressie te brengen (TEGs), en de meer recent beschreven MR1 T-cellen. Wij hebben onlangs laten zien dat TEGs in staat zijn om van patiënten afkomstige DMG-cellen te doden en hebben MR1 expressie bevestigd in DMG-patiënten tumor samples. Dus, TEGs en MR1 T-cellen zouden een waardevolle behandelingsoptie kunnen zijn voor patiënten met DMG, vooral in gevallen waar CAR T cel ligand expressie laag is. Echter, het voorspellen van hun therapeutische waarde voor DMG vereist adequate immune-oncologische modellen, die zowel de inter- als intra-tumor heterogeniteit die in patiënten wordt waargenomen nabootsen. Wij hebben daarom een platform ontwikkeld: BEHAV3D, dat organoïde technologie, 3D beeldvorming en RNA-analyse gebruikt om het werkingsmechanisme van T-celtherapieën pre-klinisch te evalueren. Omdat organoïden afkomstig van patiënten (PDO's) specifieke kenmerken van het oorspronkelijk tumorweefsel behouden, kan door middel van BEHAV3D de effectiviteit van T-celtherapieën op patiënt-specifieke wijze geanalyseerd worden. Door gebruik te maken van borstkanker PDO's, waren we in staat om zowel inter- als intra-tumor heterogeniteit in TEG-effectiviteit te onthullen. Bovendien hebben we met behulp van 3D imaging individuele T-cellen gedetailleerd kunnen volgen en daarbij een hoge mate van variatie in hun gedrag kunnen aantonen, die mede bepaald werd door het type PDO waar ze aan blootgesteld werden. Dit benadrukt het belang van organoïde technologie om T-cel anti-tumor-effectiviteit op een patiënt-specifieke manier te beoordelen. Bovendien suggereert het hoge niveau van heterogeniteit in gedrag dat T-cel-therapieën geoptimaliseerd kunnen worden door het meest effectieve gedrag te bevorderen. Door RNA-analyse in de verschillende gedragspopulaties van T-cellen uit te voeren, konden we zien welke cel signaleringsmechanismen ten grondslag liggen aan hun werkingsmechanisme. Dit leidde tot identificatie van een cel-communicatiemechanisme dat gebruikt kon worden om de werkzaamheid van T-cel therapie te vergroten, evenals een selectie marker die het mogelijk maakte cellen met  het meest actieve gedrag te isoleren en daarmee de effectiviteit van de therapie te verhogen. In dit voorstel implementeren we organoïde technologie en BEHAV3D om T-celtherapieën voor DMG te bevorderen. We stellen de hypothese dat 1) TEGs en MR1 T-cellen een nieuw immunotherapie perspectief kunnen bieden voor patiënten met DMG, mogelijk complementair aan GD2 CAR T cellen, en 2) dat de werkzaamheid van T-celtherapieën verder kan worden verhoogd door manipulatie van targets geïdentificeerd door BEHAV3D. Om deze hypotheses te testen, zullen we de in vitro en in vivo effectiviteit van TEGs en MR-1 T-cellen tegen DMG PDOs bepalen in vergelijking met GD2 CAR T cellen (Aim 1/WP1). We zullen het gedrag van T-cellen classificeren en genetische profilering van zowel organoïden als T-cellen gebruiken om targets te identificeren, die geassocieerd zijn met gevoeligheid voor behandeling in organoïden en actief aanvallend gedrag in T-cellen (Aim 2/WP2). Gebaseerd op de geïdentificeerde targets zullen we strategieën ontwerpen om T-celtherapie te optimaliseren naar een meer effectieve behandeling voor DMG (Aim 3/WP3). Om rekening te houden met inter- en intra-patiënt heterogeniteit, maken we gebruik van een recent opgerichte DMG PDO biobank en onze preliminaire data bevestigen dat DMG PDO's zowel inter- als intra-tumor heterogeniteit vertonen in GD2 expressie. Dit maakt het mogelijk om een eventueel therapeutisch voordeel van TEGs en MR1 T-cellen ten opzichte van GD2 CAR T-cellen te onderzoeken. We zullen een co-kweek opzetten van PDO's met de verschillende T-cel producten en via onze 3D beeldvorming strategie kunnen we over tijd de dood van individuele organoïden kwantificeren om zo intra-tumor heterogeniteit in gevoeligheid voor T-celtherapieën te onthullen. Bovendien zal door vergelijking van PDO’s afkomstig van minstens 10 DMG-patiënten de variabiliteit in respons tussen patiënten in kaart gebracht worden (WP1). Op basis van deze gegevens zullen we de meest relevante organoïde lijnen selecteren om in muizen te transplanteren en door middel van lokale toediening van TEGs en MR-1 T-cellen in de hersenen de in vivo effectiviteit vast te stellen in vergelijking met GD2 CAR T-cellen (WP1). Gebaseerd op zowel de data in kweek als in muizen, zullen we representatieve PDO's en de meest veelbelovende metabole T-cel therapie selecteren voor verdergaande karakterisering. Hierbij zullen we zowel het gedrag als de onderliggende genetische profielen van T-cellen in kaart brengen (WP2). Deze experimenten worden uitgevoerd met zowel PDOs die laag-gevoelig - als PDO’s die hoog-gevoelig - zijn voor T-celtherapie. Samen met PDO RNA-analyse zal dit inzicht verschaffen in hoe het inflammatoire profiel van een tumor het gedrag van T-cellen beïnvloedt. Deze bevindingen zullen vervolgens gebruikt worden om een aanpak te ontwikkelen om de anti-tumor effectiviteit verder te verhogen, gebaseerd op selectie van potente T-cel populaties, combinatie therapie met andere medicijnen, of verdere T-cel genetische manipulatie (WP3). Gebruikmakend van ons organoïde technologie, 3D beeldvorming en RNA-analyse platform, verwachten we niet alleen nieuwe T-celtherapie voor patiënten met DMG te identificeren en preklinisch te valideren, maar ook therapeutische strategien te ontwikkelen om hun werkzaamheid verder te verbeteren. We hopen dat deze therapeutische strategieën in de toekomst betere klinische vooruitzichten kunnen bieden voor patiënten met DMG.