Project Funding Details

Lung carcinoid is an orphan disease with an incidence ranging from 0.2/2 per 100.000 persons although its occurrence has increased over the past decades. Approximately 80% of carcinoids are classified as typical and 20% as atypical carcinoid according to the mitotic index (proliferation) and presence of necrosis. Up to 30% of patients with pulmonary carcinoids have metastatic progression after surgery. Known predictive factors for metastatic progression are atypical carcinoid disease and lymphatic involvement, but none can reliably be used to select patients. Extensive follow-up is therefore advised up to 10-years in each patient. Another problem in the risk assessment of clinicians for follow-up is the reported inter-observer variation (kappa 0.32) of carcinoid diagnoses differentiating typical from atypical carcinoids and the detrimental variation in diagnostic nomenclature. The prognostic and diagnostic assessment of lung carcinoids thus is in need for significant improvement. Previous development of biomarkers for metastatic progression that require further validation: By genomic profiling we recently tested molecular markers, which enabled us to accurately identify patients at risk for metastatic progression. After mRNA expression profiling by microarray analysis and subsequent validation using immunohistochemistry (IHC), OTP and CD44 were identified. OTP is an evolutionary conserved homeodomain helix-turn-helix transcription factor, with functions in the development of the neurosecretory system. It is critical for migration, proliferation and terminal differentiation of neuroendocrine cell lineages during development, and possibly also in the lung. Expression of OTP is not detected in normal neuroendocrine bodies of the lung but OTP is highly expressed in carcinoid precursor lesions (i.e. neuroendocrine cell hyperplasia and tumor lets) as well as in most pulmonary carcinoids. OTP has a specificity of 99% for lung carcinoid (>500 tumors) and only has a single protein producing transcript. Intriguingly, expression of OTP is not observed in carcinoid tumors at diagnosis that later developed metastatic disease. CD44 is a glycoprotein involved in cell adhesion an migration but not as specific and sensitive as OTP.  In a cohort of 150 patients of follow-up with sustained OTP and CD44 protein expression only one patient died because of carcinoid disease after an average of 10 years follow-up. Overall survival was significantly better predicted in comparison to the current WHO classification. Additionally, application of OTP and CD44 IHC also led to a superior prediction of prognosis in patients without consensus carcinoid type diagnosis in a histopathological inter-observer study among 5 pathologists. Published and preliminary data from sequencing analysis of predominantly typical carcinoid indicate a low number of non-synonymous mutations (0.4/MB) including sporadic mutations in MEN1 and chromatin remodeling genes but not in OTP. OTP therefore may play a crucial role in carcinoid tumorigenesis and in addition has strong prognostic significance.    From the above we hypothesize that metastatic progression of lung carcinoids is associated with neuroendocrine dedifferentiation in which (inactivation of) OTP might play a role as a tumor suppressor or an accurate messenger/indicator. In depth genomic analysis of carcinoids with loss of OTP may therefore unravel genomic alterations causing metastatic progression of lung carcinoids as well as identify new targets for treatment. In this project we aim to 1) validate OTP and CD44 expression by immunohistochemistry in a population-based nested case-control cohort, and cross validate these markers in paired preoperative biopsy specimens and subsequent surgical resected tumors; 2) unravel the possible tumor suppressor function of OTP (by activating neuroendocrine differentiation) using proliferation assays of a) OTP positive carcinoid cell lines in which OTP is downregulated with siRNA and b) in OTP negative carcinoid cell lines in which OTP is activated utilizing the CRISPR-CAS9 SAM approach. Moreover this enables us to identify downstream targets of OTP by transcriptome analysis; 3) to identify genomic alterations associated with metastatic progression of lung carcinoids using OTP as an indicator for dedifferentiated carcinoid disease, OTPhigh versus OTPlow carcinoids will be analyzed with whole genome/exome and transcriptome sequencing. Possible therapeutic targets will be validated including mutation and expression status in carcinoids showing distant metastasis identified under aim 1 and in the cell lines (aim 2). The aim of this project will be the clinical implementation of OTP and CD44 IHC markers, allowing for selection of patients requiring post-operative radiological surveillance decreasing over/under-treatment and medical costs related to treatment of patients with carcinoid disease. Moreover, it will increase our understanding of the role of OTP in lung carcinoid tumorigenesis, and will identify gene alterations and deregulated cellular pathways underlying metastatic progression in carcinoids. This will be crucial for the development of new targeted treatments which may decrease morbidity and mortality of lung carcinoids.

Achtergrond: Neuro-endocriene tumoren zijn zeldzaam en komen het vaakst in de long voor. Long- carcinoïden kunnen worden onderscheiden in typische en atypische carcinoïden aan de hand van hun deling snelheid. De voornaamste behandeling van primaire carcinoïden die nog niet zijn uitgezaaid is het verrichten van een chirurgische resectie. Tot 30% van de carcinoid-tumoren kunnen terugkeren tot 10 jaar na resectie, vaker bij atypische carcinoïden dan bij typische carcinoïden. Probleemstelling 1: Omdat de behandelend arts niet precies kan voorspellen welke patiënt een terugkerende tumor heeft, moeten alle patiënten voor een langdurige periode na operatie worden gevolgd. Door genexpressie analyse van carcinoïden hebben wij onlangs twee markers geïdentificeerd (OTP en CD44) waarmee wel nauwkeurig kan worden voorspeld welke patiënten een grote kans hebben op terugkerende ziekte. Toepassen van deze markers in de dagelijkse praktijk zou de arts de mogelijkheid geven patiënten te selecteren die zorgvuldig gevolgd moeten worden om zo tijdig in te grijpen wanneer de ziekte terugkomt. Dit zal resulteren in verlaagde zorg kosten en een betere patiënt-gespecialiseerde behandeling.   Ook vonden we dat OTP expressie uniek is voor long-carcinoïden en dat de expressie weg valt in agressieve vormen van carcinoïden met ziekte op afstand. Probleemstelling 2: wij denken dan ook OTP betrokken is bij de ontwikkeling van de long carcinoid als oorzaak (functie van tumorsuppressorgen) of als een bijeffect dat wordt gezien bij een agressieve ziekte ontwikkeling. Gnomisch onderzoek naar de functie van het OTP gen, en naar carcinoïden waarbij OTP expressie is verloren geeft ons verder inzicht in de ontwikkeling van (agressieve) long carcinoïden. In de toekomst kan dit onderzoek er voor zorgen dat we patiënten met een agressieve vorm van carcinoid beter kunnen behandelen. Onderzoeksopzet: het voorgestelde project richt zich dan ook op drie delen 1) het valideren van de markers OTP en CD44 op een groot bevolking cohort. Dit zullen wij doen door het retrospectief analyseren van een groep van 1200 patiënten met een carcinoid tussen 2003-2012 waarvan we inmiddels weten of de ziekte is terug gekomen. Hiervoor zal een team van pathologen geblindeerd voor ziekte en diagnose naar beoordeling van de markers OTP en CD44 worden gevraagd. In deel 2) willen wij het begrip van de functies van OTP verhogen door verder onderzoek te verrichten naar de genetische achtergrond van long carcinoïden door specifiek OTP gen expressie te beïnvloeden in long carcinoid cellijnen. En in deel 3) door OTP te gebruiken als een marker voor agressieve carcinoid ziekte. Hierbij zullen we carcinoïden met hoge expressie van OTP en lage expressie van OTP uitgebreid onderzoeken op genetische afwijkingen met behulp van zogenaamde next-generation sequencing technieken. Uitkomsten: de combinatie van deze onderzoekdoelen en de verbonden teams van behandelend artsen, pathologen, moleculair biologische onderzoekers en een epidemioloog zal resulteren in een toename van de diagnostische en prognostische voorspelling in patiënten met carcinoid ziekte. Ook zal het kunnen resulteren in toekomstige nieuwe behandelingen gericht op de genetische afwijkingen die voor agressieve long carcinoid ziekte zorgt.   Implementatie: dit onderzoek geld als een laatste validatie voor de implementatie van OTP en CD44 in de routine diagnostiek. Bij een positief resultaat zullen wij actief het protocol voor kleuring van OTP en CD44 in Nederland verspreiden. Ook zullen wij via de beroepsgroepen van de Nederlandse Vereniging voor Pathologie (NVVP) en de Nederlandse Vereniging voor Arts Longziekten en Tuberculose (NVALT) implementatie van OTP en CD44 in de richtlijn nastreven. Onderzoek naar mechanismen die mogelijk leiden tot agressieve long carcinoid ziekten zullen wij verder valideren in een cohort van >200 patiënten met long carcinoid ziekten in samenwerking met het International Agency for Research on Cancer (IARC). De hoofdaanvragers van dit onderzoek zijn onderdeel van een internationaal consortium dat onderzoek doet naar de metastatische progressie van long carcinoiden.