Project Funding Details

Problem Description Deficiencies in BRCA1/BARD1 heterodimer are the main cause of hereditary breast and ovarian cancer. Carrying a harmful BRCA1 mutation confers up to 90%  life-time probability to develop breast cancer.   About one third of breast cancers with a harmful BRCA1 result in triple negative breast cancer, namely negative for estrogen receptors, progesterone receptors and HER2, which are the most difficult to treat breast cancers and, therefore, the ones with poor prognosis.   BRCA1/BARD1-defficient cells are unable to repair DNA damage using the Homologous Recombination (HR) DNA Double Strand Break (DSB) repair pathway. For this reason, current treatments for BRCA1/BARD1-deficient tumors comprehends the use of platinum-based compounds or Poly-ADP-ribose Polymerase (PARP) inhibitors, which will cause DNA damage that HR-deficient cells cannot overcome. This difference ensures that cancer cells die specifically while healthy cells are not affected. This phenomenon is known as synthetic lethality. However, cancer cells are able to rapidly develop tolerance to platinum-based compounds or PARP inhibitors. Therefore, we need alternative strategies to treat these tumors.   Research direction   Human cells are constantly exposed to a vast variety of both endogenous and exogenous DNA damaging agents that challenge the integrity of their genomes. In order to overcome these damages, cells are equipped with a plethora of DNA damage sensing and repair mechanisms, which combined are known as the DNA damage response (DDR). Failures in the DDR cause genomic instability that can lead to cancer.   The components of the DDR are tightly regulated by different post-translational modifications (PTMs) including ubiquitination. This modification consists of the covalent attachment of a small protein called ubiquitin to acceptor lysines and plays a key role in the regulation of the DDR. The ubiquitination of targets is performed by the so-called ubiquitin E3 ligase enzymes.   Many E3 ligases play a role in the DDR. The BRCA1/BARD1 heterodimer possess RING domains that confer it ubiquitin E3-ligase activity. The integrity of their RING domains is important for HR. Deleterious mutations in the BRCA1/BARD1 RING domains are linked to  cancer. However, even though the BRCA1 gene was discovered almost two decades ago,  we are still limited in our understanding of the ubiquitination targets of the BRCA1/BARD1 RING E3 ligase.   In order to achieve a better understanding of the ubiquitin signaling within the DDR and how it is linked to cancer, I plan to identify target proteins for the ubiquitin E3 ligase BRCA1/BARD1 and determine their role in the DDR and the relevance of these targets for breast and ovarian cancer.   Hypothesis Since deficiencies in ubiquitin E3 ligase activity of BRCA1/BARD1 are linked to cancer, this is likely due to deregulation of the ubiquitination status of their targets. Identifying these targets could provide future strategies for cancer treatment using compounds which modulate the activity of these targets in breast and ovarian cancer which are caused by mutations that cause loss of function in these E3 ligases.   Aim/Plan of investigation Using my expertise both in the DNA damage field and in mass spectrometry-based PTM proteomics, in this project proposal, I aim to identify the ubiquitination targets of these E3 ligase enzymes in an unbiased proteome-wide approach, using novel and complementary methodology. I have developed a novel technique, termed Targets for Ubiquitin Ligases Identified by Proteomics (TULIP) which I will use for this purpose. I have already successfully applied TULIP for the identification of targets for other E3 ligases. Upon identifying the ubiquitination target landscape, the most interesting targets in the context of the DDR and cancer will be filtered out with an unbiased semi-high throughput approach using an shRNA library to knock down the identified targets in healthy and cancer cells. Genes with a phenotype in terms of resistance to DNA damaging agents or cell proliferation will be selected for further investigation, prioritizing genes linked to cancer according to the available cancer genome databases. I will describe the role of these proteins within the DDR, and how targeting the proteins in cancer cell lines affects their cellular fate.   Expected outcome Overall, this project will provide novel insight in the ubiquitination targets of BRCA1/BARD1 E3 ligases involved in the DDR and cancer, and how deficiencies in these targets affect both healthy and cancer cells. Their validity as potential targets for anti-cancer treatments will be tested, and their role within the DDR will be determined. Since functional studies are time consuming, I will focus on three targets for detailed functional analysis. Pilot experiments already identified three promising candidates. Additionally, the proteomics approach will provide system-wide insight in ubiquitin signal transduction by BRCA1/BARD1.  

Achtergrond en probleemstelling Beschadiging van DNA door endogene en exogene oorzaken vormt een constante bedreiging voor de integriteit van onze genomen. Deze beschadigingen worden gedetecteerd en gerepareerd door een uitgebreide cellulaire machinerie, bekend als de DNA schade respons. Defecten in deze respons veroorzaken genomische instabiliteit en kunnen leiden tot kanker. De componenten van de DNA schade respons zijn gereguleerd door reversibele post-translationele modificaties (PTMs), inclusief ubiquitinering. Deze modificatie bestaat uit covalente koppeling van het kleine eiwit ubiquitine aan acceptor lysines in doeleiwitten. Ubiquitinering speelt een sleutel rol in de regulatie van de DNA schade respons. De ubiquitinering van doeleiwitten wordt uitgevoerd door ubiquitine E3 ligasen. Veel ubiquitine E3 ligasen spelen een belangrijke rol in de DNA schade respons. Defecten in deze E3 ligasen kunnen leiden tot kanker. Het eiwit gecodeerd door het borst kanker gen BRCA1, samen met het partner eiwit BARD1 vormen een belangrijk ubiquitine E3 ligase. Defecten in het functioneren van BRCA1/BARD1 leiden tot borst en ovarium kanker.. Enkele honderden E3 ligasen reguleren samen enkele duizenden ubiquitine doel-eiwitten. Een groot hiaat in het onderzoeksveld wordt gevormd door het gebrek aan inzicht in de exacte doeleiwitten voor de ubiquitine E3 ligasen. Onderzoeksrichting / voorgestelde oplossing Om een beter inzicht te krijgen in de doeleiwitten van de ubiquitine E3 ligasen in de DNA schade respons en in kanker ben ik van plan om de identiteit op te helderen van de doeleiwitten van BRCA1/BARD1 en wil ik de relevantie van de doeleiwitten van BRCA1/BARD1 in de DNA schade respons en in borst en ovarium kanker bestuderen.   Relevantie Ik verwacht dat de nieuwe componenten van de DNA schade respons die in dit project worden geïdentificeerd downstream van BRCA1/BARD1 een belangrijke rol spelen in borst- en ovarium kanker. Remmers van deze nieuwe componenten van de DNA schade respons kunnen in de toekomst een onderdeel worden van anti-kanker therapie, wat moet leiden tot meer genezing van kanker patiënten, aansluitend bij de missie van KWF.   Onderzoeksvragen -Wat zijn de doeleiwitten van ubiquitine E3 ligases die een sleutelrol vervullen in kanker met de focus op doeleiwitten van BRCA1/BARD1? -Welke functionele rol spelen de doeleiwitten van BRCA1/BARD1 in de DNA schade respons en in kanker?   Onderzoeksopzet Ik zal mijn expertise in de DNA schade respons en in massa spectrometrie-gebaseerde proteomics gebruiken in dit project om de identiteit te achterhalen van de doeleiwitten van ubiquitine E3 ligasen m.b.v. een open en onpartijdige aanpak gebaseerd op nieuwe en complementaire methodologie. Recent heb ik voor dit doeleinde de TULIP technologie ontwikkeld, wat staat voor Targets voor Ubiquitine Ligasen geIdentificeerd m.b.v. Proteomics. Ik heb aangetoond dat deze techniek gebruikt kan worden om doeleiwitten te vinden voor ubiquitine ligasen te vinden. Na het identificeren van de doeleiwitten voor BRCA1/BARD1 zal ik de meest interessante doeleiwitten functioneel ontleden wat betreft hun rol in de DNA schade respons en in kanker. Het vaststellen van de meest relevante eiwitten in deze context zal ik doen door een onpartijdige knockdown aanpak m.b.v. een shRNA en CRISPR bibliotheek beschikbaar op onze afdeling. Doeleiwitten die belangrijk zijn voor de reparatie van beschadigd DNA en voor celproliferatie zal ik selecteren voor functioneel onderzoek, waarbij ik genen gelinked aan kanker zal prioriteren m.b.v. kanker genoom databases. De rol van deze eiwitten in de DNA schade respons wil ik ophelderen en ik wil onderzoeken hoe het uitschakelen van deze eiwitten in kanker cellen het lot van deze cellen beïnvloed.   Verwachtte uitkomsten Ik verwacht in dit project inzicht te verkrijgen in de DNA schade respons en in kanker wat betreft de identiteit van doeleiwitten van de belangrijke ubiquitine E3 ligasen BRCA1/BARD1 die een sleutel rol spelen in borst- en ovarium kanker. Ik verwacht nieuw functioneel inzicht in de rol van deze doeleiwitten in kankercellen en in normale cellen. Omdat deze functionele studies intensief en tijdrovend zijn zal ik focussen op de twee belangrijkste doeleiwitten. De proteomics aanpak zal systematisch inzicht opleveren van het ubiquitine netwerk dat aangestuurd wordt door BRCA1/BARD1.    Omschrijving van de stappen die nodig zijn om het resultaat te implementeren. -Nieuwe componenten van de DNA schade respons die in dit project worden ontdekt zullen worden gepatenteerd als mogelijke biomarkers voor de classificatie van borst- en ovarium kanker en mogelijke andere vormen van kanker en als mogelijke doelwitten voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Dit patent dient om de IP-rechten te beschermen -Antilichamen tegen deze eiwitten zullen worden ontwikkeld om deze mogelijke biomarkers te evalueren in patiënten materiaal. -Remmers van deze nieuwe componenten van de DNA schade respons zullen worden ontwikkeld om gebruikt te worden voor de behandeling van borst- en ovarium kanker en mogelijke andere vormen van kanker.