Project Funding Details

Problem: Emerging evidence implicates membrane-associated glycerophosphodiesterases (GDEs or GDPDs) in promoting cell differentiation and suppressing malignancy in various cancers (e.g. neuroblastoma and breast cancer). However, we are far from understanding the regulation and mode of action of these new players in cancer biology.   Preliminary results: GDE2 and GDE3 are multi-pass membrane proteins with an extracellular catalytic domain that releases specific glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins that co-regulate cancer-associated signalling pathways. GDE2 cleaves and releases RECK, an inhibitor of Notch signalling, a major target in cancer therapy. We now find that GDE2 also releases glypican-6 (Cancer Cell, manuscript under revision) and thereby promotes neuroblastoma differentiation. GDE3 releases the urokinase receptor (uPAR) to suppress signalling activity in breast cancer cells. Furthermore, expression of GDE2 and GDE3 correlates with favourable clinical outcome in neuroblastoma and breast cancer, respectively. A third GDE family member, the membrane-anchored GDE4, functions as an intracellular phospholipase D whose expression correlates with favourable clinical outcome in neuroblastoma and lung cancer. Remarkably, GDE4 does not target GPI anchors, but instead generates bioactive lipids implicated in regulating apoptosis and cell proliferation.    Aim: To understand the role of GDEs in cancer and validate them as potential targets for therapy by elucidating their regulation and substrate specificity from the cellular to the atomic structure level.   Plan of investigation: We will identify and validate new GPI-anchored substrates for GDE2 and GDE3, and examine how their activity is regulated by cell-surface expression and membrane trafficking, using N- and C-terminal tail and domain-swapping experiments. To understand the diversity of substrate specificity within the GDEs family, we will clarify the GDE4 subcellular localization using overexpression and knockout studies, finding how GDE4-mediated production of bioactive lipids affects the malignant phenotype.    To understand the specificity and regulation of the GDE family, providing feedback to functional studies, we will determine the crystal structure of GDE4 using available crystals of catalytically active recombinant GDE4, and aim at determining the structure of GDE2/3. The GDE4 crystal structure, a major advance in the field on its own right, will also provide insights into the GDE family as a whole, and in understanding GDE2/3 catalysis.   Significance: Research on GDEs opens new possibilities in an emerging field with direct implications for cancer therapy. We are in a unique position to explore the cancer-related functions of GDE2-4, at the molecular and cellular level, providing atomic level mechanistic information that will help to identify small-molecule allosteric modulators.   

Achtergrond en probleemstelling Ons recente onderzoek laat zien dat glycerofosfodiesterases (GDEs of GDPDs) het maligne fenotype van tumorcellen kunnen onderdrukken. Glycerofosfodiesterases vormen een familie (GDE1-6) van transmembraan enzymen met een extracellulair catalytisch domein waarvan de functie lang onduidelijk was. Een doorbrak kwam met de ontdekking dat GDE2 en GDE3 fungeren als glycosylphospatidylinositol (GPI)-specifieke fosfolipases . GDE2 en GDE3 klieven specifieke GPI-verankerde eiwitten op het celoppervlakn en beinvloeden daardoor de cellulaire signaaltransductie en onderdrukken het maligne fenotype. Een derde familielid, GDE4, is daarentegen een intracellulair lysofosfolipase D dat o.a. het bioactieve lipide LPA produceert. Hoge expressie van zowel GDE2 en GDE3 als GDE4 blijkt sterk geassocieerd met een gunstige prognose in o.a. neuroblastoma, borst- en longkanker patienten. We begrijpen echter nog weinig van deze nieuwe spelers in de tumorbiologie. Het is nu van groot belang om het werkingsmechanisme, de substraatspecificiteit en de regulatie van genoemde GDEs nader te onderzoeken teneinde nieuwe therapeutische aanknopingspunten te vinden. Recente ontdekkingen Ons onderzoeksvoorstel is gebaseerd op de volgende ontdekkingen: 1. GDE2 (of GDPD5) induceert differentiatie van neuroblastomacellen in vitro en is een gunstige prognostische factor in neuroblastoma patienten. GDE2 hydrolyseert het GPI-anker van glypican-6, resulterend in een veranderde Rac/RhoA activiteitsbalans en de expressie van differentiatie-regulerende genen (E. Matas-Rico et al., GDE2 promotes neuroblastoma differentiation through glypican release and is a marker of clinical outcome. Cancer Cell, ms onder revisie). 2. GDE3 (of GDPD2) is een GPI-specifieke fosfolipase C dat het GPI-anker van de urokinase receptor (uPAR) klieft, hetgeen leidt tot remming van uPAR activiteit en ondrukking van invasieve migratie in borstkankercellen. Hoge GDE3 expressie correleert met een betere overleving in borstkankerpatienten (M. van Veen et al., ms in voorbereiding). 3. Hoge expressie van GDE4 (of GDPD1), een intracellulair lysfosfolipase D dat o.a. bioactief LPA genereert, correleert met een betere overleving in diverse soorten kanker, incl. neuroblastoma en longkanker. Kristallen van recombinant full-length GDE4 zijn recent door ons geproduceerd. Onderzoeksplan Het werkplan bestaat uit twee onderdelen (work packages), die onderling nauw verwant zijn en gelijktijdig uitgevoerd zullen worden. (1) Identificatie and karakerisering van nieuwe GPI-verankerde substraten voor GDE2 and GDE3 dmv een alfa-toxin protocol, en onderzoeken hoe de activitiet van GDE2 en GDE3 gereguleerd wordt via mebraanexpressie en ‘’endo-exocytic trafficking’’ door middel van ‘’domain-swapping’’ experimenten. Daarnaast zullen we het werkingsmechinsme van GDE4 onderzoeken door middel van overexpressie and knockout experimenten, mte name hoe GDE4 het gedrag na kankercellen beinvloedt. (2) Bepaling van de kristalstructuur van GDE4 om de specificiteit en regulatie van de GDEs te begrijpen, en terugkoppeling te geven aan de experimenten onder (1). Kristallen van catalytisch actief recombinant GDE4 zijn inmiddels door ons geproduceerd. Opheldering van de GDE4 structuur zal nieuwe inzichten geven in het catalytisch mechanisme van de GDE familie in het algemeen, en dat van GDE2 en GDE3 in het bijzonder. Het zal bovendien de weg openen naar de structuurbepaling van zowel GDE2 als GDE3. Verwachte uitkomsten Hoge expressie van GDE2, GDE3 and GDE4 is sterk geassocieerd met betere overlerving in diverse kankers, suggererend dat deze enzymen kunnen fungeren als tumor suppressors. Ons onderzoek zal leiden tot opheldering van de structuur het werkingsmechanisme van deze GDEs, en daarmeer de weg openen tot nieuwe therapeutische mogelijkheden, met name de ontwikkeling van farmacologische (allosterische) modulatoren van GDE biochemische en biologische activiteit.